ABSTRAK
Kromatografi vakum cair (KVC) merupakan kromatografi yang dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolit sekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai adsorben dan berbagai perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen. Sampel yang digunakan adalah ekstrak kulit batang nangka yang terlebih dahulu telah dilakukan penarikan ekstraknya dengan menggunakan alat soklet. Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering dengan penjerap silika gel KL 254 dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah (n-heksana) dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom dan dihisap perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan mengvakumkannya. Kolom, dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah (n-heksana) lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dengan cara elusi gradien antara n-heksana:etil asetat:metanol, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi.
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Alat Kromatografi adalah suatu alat umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Alat Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1930, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang barisi kapur (CaSO4). Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggukan alat kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi peroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu alat dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Pada tahap awal alat kromatografi cair menggunakan kolom dari gelas dengan diameter 1 sampat 5 cm dengan panjang 50 sampai 500 cm dan phase diam berdiameter 150-200 m. Laju alir sangat lambat, sehingga pemisahan sering sampai berapa jam bahkan ½ hari. Hal ini jelas kurang menguntungkan, maka diusahakan cara-cara mempercepat pemisahan. Usaha tersebut adalah dengan menggunakan pompa untuk mengalirkan fase gerak, ternyata efisiensi pemisahan menjadi turun dan hal ini dapat diatasi dengan memperkecil ukuran partikel fase diam. Sejak tahun 1960, sudah ditemukan teknologi pembuatan partikel fase diam m. Dengan fase diam dengan diameter kecil sampai 10 partikel-partikelnya kecil memerlukan tekanan yang tinggi agar laju alir menjadi besar. Pada tahun 1967-1969, Kirland, Huber dan Havarth memperkenalkan prinsip serta alat kromatografi cair dengan tekanan 5000 psi (300 atm). Sekarang ini telah ditemukan alat kromatografi cair yang digunakan dalam kondisi vakum, sehingga lebih cepat dan evisien, alat ini disebut kromatografi vakum cair (KVC).
1.2. Tujuan Percobaan
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mendapatkan senyawa-senyawa metabolit sekunder melalui metode isolasi menggunakan KVC
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau pada tekanan lebih besar dari atmosfer dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya gas nitrogen. Untuk keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan kromatografi kolom vakum cair, oleh karena itu syarat utama adalah mengetahui gambaran pemisahan cuplikan pada kromatografi lapis tipis (Harris, 1982).
Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolit sekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen (Helfman, 1983).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak berupa gas, disebut kromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair, disebut kromatografi cair (Hendayana, 1994).
Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai (Hostettman, 1986).
Kromatografi ialah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-zat terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan suatu benda penyerap. Cara ini umum dilakukan pada pemisahan zat-zat berwarna (bahasa Yunani: chromos = warna) (Kennedy, 1990).
Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran larutan dengan perbandingan pelarut dan kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi kolom lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa (Schill, 1978).
BAB III
METODE PERCOBAAN
1.1. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah :
§ Seperangkat alat KVC,
§ Erlemeyer
§ rotary evaporator
§ batang pengaduk
Bahan yang digunakan adalah :
§ silika gel
§ n-heksana
§ etil asetat
§ metanol
Sampel yang digunakan adalah :
§ ekstrak n-heksana kulit batang nangka.
1.2. Konstanta fisik
Konstanta fisik dari bahan yang digunakan adalah sebagai berikut :
à n-heksana (C6H14)
BM = 86,18 g/mol, Tb/oC = -95 oC, Tm/oC = 69 oC, Valve = 11 mg/L
à metanol (CH3OH)
BM = 32 g/mol, Td = 68 oC, Tm/K = 175,47 K, Tb/K = 337,7 K, Tc/K = 512,64 K, ρc/Mρa = 8,092, Vc/cm3/mol = 118
à etil asetat (C2H5COOH)
BM = 72,08 g/mol
1.3. Cara Kerja
Sebanyak 5 gram n-heksana kulit batang nangka dipisahkan menggunakan kolom kromatografi vakum dengan silika gel GF254 sebagai fasa diam dan eluen n-heksana:etil asetat(elusi gradien) dengan komposisi eluen yang terlebih dahulu dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Sampel dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi fasa diam kemudian dielusi dengan fasa gerak dengan perbandingan sebagai berikut :
| n-heksana | Etil asetat |
| 100 % | |
| 90 % | 10 % |
| 80 % | 20 % |
Setiap perbandingan eluen ditampung di dalam wadah yang sama. Kemudian dilakukan penggabungan fraksi yang mempunyai pola noda yang sama melalui Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fraksi yang diperoleh diuji fitokimia untuk menentukan kandungan senyawa yang terdapat pada masing-masing fraksi.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Data Hasil Pengamatan
Dari percobaan yang dilakukan didapatkan fraksi I pada eluen perbandingan (elusi eluen) 80 % : 20 % yang pada kolom kromatografi terlihat pita berwarna kuning.
Catatan : pada eluen selanjutnya tidak dilakukan lagi percobaan, karena pada saat percobaan terjadi kesalahan pada arus listrik (mati lampu), jadi percobaan ini tidak dilanjutkan lagi mengingat waktu yang tidak memungkinkan lagi.
4.2. Pembahasan
Kromatografi adalah pemisahan berdasarkan distribusi dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Salah satu contoh kromatografi adalah kromatografi vakum cair (KVC) dan kromatografi gas (KG). Perbedaan dari kedua kromatografi ini yaitu pada proses kromatografi gas itu menggunakan gaya grafitasi untuk menarik sampel artinya sampel akan keluar dengan sendirinya atau tanpa paksaan. Sedangkan kromatografi vakum cair sampel itu dipaksa atau dihisap dengan menggunakan silang dan tanpa tekanan dalam kondisi vakum.
Pada KVC, fase diamnya menggunakan silika gel yang diletakkan di dalam kolom kromatografi. Silika yang digunakan adalah silika KL 254, yaitu silika halus.Silika gel ini
Pada mulanya silika gel masih belum aktif, dan untuk mengaktifkannya sebaiknya setelah dicampurkan dengan n-heksana lalu dipanaskan pada suhu diatas 45oC. Namun, pada percobaan ini tidak dilakukan pemanasan. Ada dua cara melapisi kolom dengan silika gel yaitu proses basah dan proses kering. Proses basah yaitu silika gel ditambahkan dengan n-heksana hingga berbentuk seperti bubur, lalu dituangkan kedalam kolom, dan dihisap pelarutnya dengan mesin vakum, dan dihentikan sampai panjang kolom sesuai dengan yang diinginkan, maka diperoleh silika gel yang padat pada kolom. Yang kedua proses kering yaitu memasukkan silika gel yang dalam bentuk padat langsung kekolom lalu dipadatkan. Pada percobaan ini, pembuatan kolom dengan silika gel dilakukan dengan cara proses basah. Pada saat silika gel dicampurkan dengan n-heksana terlihat bahwa kedua senyawa ini tidak bercampur, hal ini dikarenakan n- heksana dan silika gel berbeda kepolarannya, yaitu n-heksana merupakan non polar dan silika gel polar. Kita tidak menggunakan metanol (CH3OH) karena senyawa ini polar, dan dapat mengakibatkan semua senyawa akan turun.
Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering dengan penjerap silika gel KL 254 dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah (n-heksana) dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom dan dihisap perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan mengvakumkannya. Kolom, dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah (n-heksana) lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dengan cara elusi gradien antara n-heksana:etil asetat:metanol, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi.
Adapun KVC ini merupakan pemisahan fraksi berdasarkan pelarutnya. Agar fraksi tertentu turun, maka harus ditingkatkan kepolarannya dari non polar, sedikit polar, semi polar, agak polar sampai 100% polar, hal ini dikarenakan didalam sampel itu terdapat senyawa yang berbeda kepolarannya. Untuk meningkatkan kepolaran pelarut dilakukan perbandingan campuran pelarut, pada mulanya pelarut non polar dicampur dengan pelarut semi polar dengan perbandingan tertentu, dan sampai nanti pelarut semipolar dicampur dengan pelarut polar dengan perbandingan tertentu. Sampel atau fraksi yang turun itu sesuai dengan kepolaran pelarut yang digunakan. Bila pelarut yang digunakan adalah n-heksana (non polar) maka fraksi yang akan turun adalah senyawa non polar, sedangkan senyawa polar tidak turun karena tidak larut dengan pelarut n-heksana. Sebelum fraksi itu diturunkan, kita akan melihat pita-pita warna pada kolom kromatografi. Dari percobaan yang dilakukan didapatkan fraksi I pada eluen perbandingan (elusi eluen) 80 % : 20 % yang pada kolom kromatografi terlihat pita berwarna kuning.
Pengaruh lebarnya kolom pada KVC mengakibatkan fraksi sampel turun satu persatu, dan bila pelarutnya telah habis maka harus dibuat pelarut dengan kosentrasi sama, dan diturunkan kembali fraksinya. Sedangkan panjang kolom, mengakibatkan semakin panjang kolom maka waktu atau cepat lambatnya turun fraksi senyawa.
Setelah fraksi senyawa didapatkan, selanjutnya dengan menggunakan KLT kita menghitung Rf (retention fraksion), dimana bila didapat senyawa yang Rfnya sama atau pola nodanya sama, maka kemungkinan senyawa itu adalah sama. Dan terakhir, kita uji fitokimia dari senyawa tersebut (ekstraks n- heksana kulit batang nangka). Namun langkah ini tidak dapat dilakukan karena waktu yang tidak mengizinkan lagi.
BAB V
KESIMPULAN
Dari percobaan ini dapatlah disimpulkan bahwa :
- Kromatografi vakum cair sampel beserta eluen itu dipaksa atau ditarik dengan menggunakan pompa dan tanpa tekanan karena dilakukan dalam kondisi vakum.
- Dari percobaan yang dilakukan didapatkan fraksi I pada eluen perbandingan (elusi eluen) 80 % : 20 % yang pada kolom kromatografi terlihat pita berwarna kuning.
- Pada KVC, fase diamnya menggunakan silika gel yang diletakkan di dalam kolom kromatografi. Silika yang digunakan adalah silika KL 254, yaitu silika halus yang ditambahkan dengan n-heksana sampai menjadi bubur kemudian dimampatkan ke dalam kolom kromatografi.
- KVC merupakan pemisahan fraksi berdasarkan pelarutnya. Agar fraksi tertentu turun, maka harus ditingkatkan kepolarannya dari non polar, sedikit polar, semi polar, agak polar sampai 100% polar, hal ini dikarenakan didalam sampel itu terdapat senyawa yang berbeda kepolarannya.
DAFTAR PUSTAKA
Harris, et.al. 1982. AN INTRODUCTION TO CHEMICAL ANALYSIS, Savders College
Heftmann, E. 1983. STEROIDS DALAM KROMATOGRAFI, Fundamentals and Aplication, Amsterdam.
Hendayana, Sumar, dkk. 1994. KIMIA ANALITIK INSTRUMENTASI, IKIP Semarang Press, Semarang.
Hostettmenn, K, dkk. 1986. CARA KROMATOGRAFI PREPARATIF, ITB, Bandung.
Kennedy, John. 1990. ANALYTICAL CHEMISTRY PRINCIPLES, Sounders College Publishing, New York
Schill, Goran. 1978. SEPARATION METHODS, Swedish Phasma Centrical Press, Stockholm
